Hibridación

La hibridación in vitro es un fenómeno importante y muy utilizado en todas las áreas de la biología molecular. Recuerda que la temperatura (y algunos agentes químicos) pueden desnaturalizar el DNA de forma reversible siempre que la temperatura (o la sustancia) disminuya lentamente. Si se hace descender bruscamente, cada hebra de DNA tiende a reasociarse consigo misma y formar un ovillo que se estabiliza por fuerzas intramoleculares. Como consecuencia, se obtiene un DNA sin utilidad y cuya absorbencia es menor que el desnaturalizado, pero mayor que como dsDNA.

Principios básicos

La hibridación entre secuencias se basa en la especificidad de la interacción entre las bases nitrogenadas de distintas cadenas, de manera que se favorezca su asociación y se disminuya la posibilidad de reasociaciones intracatenarias así como las hibridaciones inespecíficas. Para empezar, hay que contar con una secuencia diana (target) dentro de un fragmento de DNA y con una sonda (probe), que no es más que un fragmento pequeño de DNA de secuencia conocida y complementaria a la secuencia de diana. Cuando la sonda y la diana se encuentran, el dúplex se identifica con radiactividad, fluorescencia o colorante, según de la manera en que la sonda se haya marcado.

El DNA a hibridar debe digerirse previamente con una o varias enzimas de restricción para dar lugar a una serie de fragmentos individualizados que se pueden resolver en una electroforesis en un gel de agarosa. Este gel de agarosa se «replica» sobre un filtro de nitrocelulosa o nilón mediante la transferencia (blot) del DNA desde el gel hasta el filtro. Esta transferencia se produce por capilaridad desde el gel hasta el filtro. También se han desarrollado métodos rápidos por transferencia al vacío. Para que el DNA se transfiera es necesario sumergir el gel en una solución alcalina, de manera que éste de desnaturaliza al romperse los puentes de hidrógeno. La desnaturalización del DNA es esencial para que, posteriormente, la sonda pueda encontrar su secuencia complementaria. Si el DNA a transferir es de gran tamaño, entonces conviene dar antes un tratamiento con rayos UV o una solución ácida para introducir mellas que permitan que los fragmentos difundan a través de la agarosa. A continuación, el gel se neutraliza para permitir que el DNA desnaturalizado se transfiera como cadenas sencillas a la membrana.

Una vez inmovilizado el DNA sobre el filtro, se rastrea (screening) el fragmento con la sonda específica. Se forman así una serie de DNA híbridos bicatenarios cuya estabilidad va a depender de la cantidad de bases apareadas: cuanto más larga es la sonda y más bases se aparean y más estable es el híbrido. En general, a mayor grado de hibridación, mayor conexión evolutiva entre especies, y viceversa.

Control de la hibridación

La especificidad de la hibridación se puede modificar mediante:

•   La cantidad de GC que tiene la secuencia que se hibrida: a mayor %GC, más fuerte resulta la hibridación y más alta será la temperatura a la que se pueden hibridar para garantizar la especificidad de la hibridación.

•   También influye la composición de bases de la sonda, ya que a mayor %GC, más fuerte resulta la hibridación.

•   El número de copias de la secuencia de diana es clave, puesto que un número demasiado bajo hace que la técnica no tenga suficiente sensibilidad como para que, después de haberse hibridado la sonda con la diana, podamos detectar tales híbridos.

•   La concentración de la sonda es también clave por la misma razón que la anterior.

•   El tamaño de la sondava a permitir que se hibriden suficientes pares de bases de manera que el híbrido sea suficientemente estable para que se pueda detectar y no se deshaga durante las manipulaciones. Con unos cientos de pb basta: por la forma en la que se preparan las sondas (son fragmentos de la plantilla), no suele tener sentido elegir sondas de varias kilobases de longitud.

•   El rigor (stringency) de la hibridación. Con este concepto se agrupan varios factores experimentales como la temperatura, el tiempo y la fuerza iónica entre otras. Se trata del grado de especificidad del apareamiento conseguido en los híbridos. De él va a depender que sólo se apareen las secuencias exactamente complementarias, o simplemente muy parecidas, según sean los objetivos del experimento. Hay que procurar que no sea tan alto que impida el apareamiento de la sonda homóloga, ni tan bajo que permita una hibridación inespecífica con secuencias poco relacionadas. En este último caso, se diría que hay mucho ruido de fondo (background) en el ensayo. Para conseguir unas condiciones muy rigurosas hay que subir la temperatura, disminuir la fuerza iónica, y añadir formamida o urea.

Tipos de hibridaciones

Las características principales de la hibridación que hemos venido comentando corresponden a la transferencia Southern desarrollada en 1975 por Edward. M. Southern y cuya principal ventaja es que el DNA diana se encuentra fijado sobre un soporte sólido. Inicialmente se utilizó nitrocelulosa a la que se unía covalentemente el DNA al vacío. Hoy se usan membranas de nilón, que son menos delicadas y basta con exponerlas al UV unos minutos para que el DNA se fije a ella. Requiere una separación electroforética, desnaturalización, transferencia, hibridación y detección del DNA de la diana.

De una manera similar, está la transferencia Northern cuyo nombre viene por un juego de palabras con el apellido del autor de la transferencia Southern. El razonamiento es idéntico al anterior, salvo que las moléculas que se separan son de RNA y se emplea medio ácido para desnaturalizar, en lugar del básico. Suele emplearse para obtener información sobre el tamaño del RNA o la expresión de los genes.

La transferencia en ranura (slot-blot) es también análogo al Southern, pero no necesita una previa purificación ni separación de los ácidos nucleicos, sino que éstos se depositan en masa sobre una ranura (slot) que permite fijarlo en una determinada posición sobre un filtro de nilón o nitrocelulosa. Si en lugar de depositarlo en una ranura se deposita gota a gota, se denomina transferencia puntiforme (dot-blot).

También se realizan hibridaciones directamente sobre colonias de bacterias o de levaduras que se han transferido directamente sobre un filtro: hibridaciones Grunstein (el nombre de nuevo proviene del autor que la describió). Permite localizar colonias de una genoteca que contienen una determinada secuencia.

Los modernos análisis con micromatrices (microarray) siguen los mismos principios de la transferencia Southern, solo que en el soporte de cristal (es un portaobjetos) se fijan miles de sondas, y lo que se marca y se añade para la hibridación es la diana (normalmente RNA de una situación fisiológica). De esta manera, se verifica el comportamiento de miles de genes en un momento determinado —en lugar de ver qué le pasa a un gen en unas poquitas condiciones, como ocurre en el southern—.

Hay otra serie de técnicas como la PCR, secuenciación, hibridaciones in situ, análisis de inicio de transcripción etc. en las que la hibridación se produce en medio líquido y luego se detectan los híbridos de muy diversas formas.