PRINCIPIOS BÁSICOS DE CITOGENÉTICA

ACTIVIDAD COOPERATIVA: PADLET SOBRE APLICACIONES DE CITOGENÉTICA

ARTICULO DE AMPLIACIÓN SOBRE ENZIMAS DE RESTICCIÓN

Primeras proteínas humanas obtenidas por  ADN recombinante: somatostatina e insulina

Insulina

La insulina (del latín insula, "isla") es una hormona polipeptídica formada por 51 aminoácidos, producida y secretada por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas, en forma de precursor inactivo llamado proinsulina. Esta pasa al aparato de Golgi, donde se modifica, eliminando una parte y uniendo los dos fragmentos restantes mediante puentes disulfuro. La insulina interviene en el aprovechamiento metabólico de los nutrientes, sobre todo con el anabolismo de los carbohidratos. Su déficit provoca la diabetes mellitus y su exceso provoca hiperinsulinismo con hipoglucemia.

Islotes de Langerhans

Gran número de estudios demuestran que la insulina es una alternativa segura, efectiva, bien tolerada y aceptada para el tratamiento a largo plazo de la diabetes tipo 1 y la diabetes tipo 2, incluso desde el primer día del diagnóstico.

Frederick Grant Banting (1891-1941), Charles Best (1899-1978), James Collip, y J.J.R. Macleod de la Universidad de Toronto, Canadá, descubrieron la insulina en 1922. El Doctor Banting recibió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por descubrir esta hormona aunque se demuestro que el verdadero descubridor fue Nicolae Paulescu en 1923.

Estructura tridimensional de la insulina

En 1922 se probó clínicamente la hormona en un paciente, con éxito. La compañía americana Elli Lilly & Co. (Indianápolis) fue la primera en recibir una licencia exclusiva para un año y produjo “Iletin” en grandes cantidades.

Éste fue el disparo de salida para el consorcio que aún hoy existe entre las mayores compañías productoras de insulina en el mundo. A partir de ese año, el comité de la Universidad de Toronto se dedicó a intereses diferentes. En Alemania fueron los del médico Oscar Minkowski (1858-1931).

Minkowski lo cuestionó en 1923 en la fábrica de colorantes Hoechst. En la Hoechst ya se había recogido anteriormente material glandular de los mataderos de Frankfurt y Karlsruhe y habían intentado obtener insulina. A principios de noviembre de 1923 se produjo el desarrollo de la “antigua insulina” en el mercado, con la autorización de Canadá. De ahí en adelante Hoechst fue la conductora de la investigación en insulina y todavía controla, bajo el nuevo nombre de Sanofi-Aventid, junto con Eli Lilly, Novo Nordisk y Berlin Chemie, el mercado alemán.

Muchas otras compañías probaron suerte, pero fallaron en la materia prima: la recogida de material de muchos pequeños mataderos alemanes era ardua. ¡Se pensó en el enorme matadero descrito por Upton Sinclair en Chicago! Los páncreas se debían importar.

En 1936, la compañía Hoechst fue la primera que consiguió producir hormona cristalizada concentrada. Las disoluciones producidas se purificaron mejor de las proteínas exógenas acompañantes y así fueron más funcionales. También se trabajó en las insulinas depot. En 1938 llegó al mercado la “insulina depot Hoeschst” con estabilizadores superficiales. Sin embargo, durante la guerra se mantuvo el suministro mediante un nuevo procedimiento para asegurar la conservación de las glándulas. Sin embargo, en los primeros años tras 1945 la producción fue baja. Hoechst continuó como principal proveedor y lanzó al mercado en 1953 la “Long-insulin”, que actuaba más tiempo. Entonces, Frederick Sanger consiguió, tras 10 años de trabajo, determinar la estructura de la insulina.

Entre 1963 y 1965 se logró, en diversos grupos de trabajo, la síntesis total de la insulina, y en 1969 Dorothy Crowfoot-Hodgkin utilizó el análisis estructural por rayos X para clarificar su estructura espacial.

Funciones de la insulina

La insulina tiene una importante función reguladora sobre el metabolismo, sobre el que tiene los siguientes efectos:

• Estimula la glucogenogénesis.
• Inhibe la gluconeogénesis y la glucogenolisis.
• Promueve la glucólisis.
• Favorece la síntesis de triacilgliceroles (triglicéridos). Para ello, estimula la producción de acetil-CoA (por ejemplo, al acelerar la glucólisis), y también estimula la síntesis de ácidos grasos (componentes de los triacilgliceroles) a partir de la acetil-CoA.
• Estimula la síntesis de proteínas.
• “Utilización diaria” de insulina por los humanos: 1.8 mg aproximadamente. 

Insulina y diabetes

El organismo humano la utiliza para regular el metabolismo del azúcar, y la incapacidad para producir la insulina, genera la enfermedad conocida como diabetes. Normalmente es producida en el páncreas y los diabéticos que no producen esta proteína, pueden contender con la enfermedad mediante la inyección de la hormona. Antes de que la insulina se produjera por métodos de DNA recombinante, se obtenía del páncreas de animales; sin embargo, la insulina de origen animal no es idéntica a la humana y en algunos individuos genera reacciones alérgicas. 

Estructura primaria de la insulina humana, mostrando las cadenas A y B

La figura muestra la hormona insulina humana. Ésta es una molécula formada por dos péptidos llamados A y B, de 21 y 30 residuos de aminoácidos, respectivamente. Las dos cadenas A y B de insulina están unidas entre sí por dos puentes disulfuro. Existe además, un puente disulfuro adicional entre residuos de aminoácidos de la cadena A. 

Mecanismo de liberación de insulina dependiente de glucosa en las células b del páncreas

La ARN polimerasa empieza su trabajo de transcripción tras estas secuencias. Los finales del ARNm transcrito en eucariotas se modifican con un 5’-cap (“caperuza”) y una cola de 3’-poliA (adeninas). La caperuza debe proteger de la degradación por enzimas (fosfatasas y nucleasas) y refuerza la traducción. La cola poliA no se codifica en el ADN y estabiliza abiertamente el ARNm. 

También la velocidad de la síntesis de insulina puede regularse incluso tras la traducción en el ribosoma; la preproinsulina (128 aminoácidos) es más larga que la hormona  activa. Enzimas especiales fragmentan en el extremo amino a una corta parte (24 aminoácidos), que sirve como secuencia señal para atravesar la membrana del retículo endoplasmático. A continuación, la proinsulina creada de esta manera se separa de ella liberando la parte central de la cadena polipeptídica (péptido C). Las dos cadenas cortas A y B forman la insulina terminada. Mediante puentes disulfuro entre cisteínas se mantienen unidas.

Tras su síntesis, la cantidad de proteína activa se regula frecuentemente en el cuerpo por retroacoplamiento.

Cómo se sintetiza la insulina en humanos: desde la proinsulina, hasta la insulina activa

La insulina es una pequeña hormona que consta de dos cadenas proteicas, de las cuales una tiene 21 aminoácidos (cadena A) y la otra 30 (cadena B). A partir de 1945 Fred Sanger investigó, durante diez años de largo y duro trabajo en el sótano del Instituto Bioquímico de Cambridge (Inglaterra), la estructura primaria de la insulina.

Se representa un gen de insulina típico de una célula de un mamífero, con intrones, secuencias codificadoras (exones) y secuencia de regulación, que se utilizan para la transcripción. 

Brevemente, antes del inicio del gen de la insulina (en la región que bordea el extremo 5’), se encuentran varios elementos de secuencia que son decisivos para la producción de insulina. Diversas proteínas de regulación se unen a estas secuencias y se activan. Diversas proteínas de regulación se unen a estas secuencias y se activan. En las células que no producen insulina se bloquean los fragmentos de ADN mediante otras proteínas. 

 

La ARN polimerasa empieza su trabajo de transcripción tras estas secuencias. Los finales del ARNm transcrito en eucariotas se modifican con un 5’-cap (“caperuza”) y una cola de 3’-poliA (adeninas). La caperuza debe proteger de la degradación por enzimas (fosfatasas y nucleasas) y refuerza la traducción. La cola poliA no se codifica en el ADN y estabiliza abiertamente el ARNm. 

También la velocidad de la síntesis de insulina puede regularse incluso tras la traducción en el ribosoma; la preproinsulina (128 aminoácidos) es más larga que la hormona  activa. Enzimas especiales fragmentan en el extremo amino a una corta parte (24 aminoácidos), que sirve como secuencia señal para atravesar la membrana del retículo endoplasmático. A continuación, la proinsulina creada de esta manera se separa de ella liberando la parte central de la cadena polipeptídica (péptido C). Las dos cadenas cortas A y B forman la insulina terminada. Mediante puentes disulfuro entre cisteínas se mantienen unidas.

Tras su síntesis, la cantidad de proteína activa se regula frecuentemente en el cuerpo por retroacoplamiento. 

El propósito del análisis de la insulina se considero intrépido en su tiempo. La insulina cristalizada de 120 toros sirvió a Sanger como materia prima. Fred Sanger recibió el Premio Nobel en 1957, sólo tres años después de haber descifrado la secuencia de los 51 aminoácidos de las dos cadenas de la insulina.

Ambas cadenas se sintetizan primero como parte de una cadena más larga de 110 aminoácidos en las células B (células β) de los islotes de Langerhans en páncreas. Esta forma larga es la preproinsulina. Al igual que para otras hormonas peptídicas, estas proteínas precursoras se fragmentan en el retículo endoplasmático. Sus primeros 24 aminoácidos sirven como señal para la membrana celular para la secreción de la insulina fuera de la célula. En la salida a través de la membrana se rompen estos 24 aminoácidos mediante enzimas (peptidasas) y permanecen en la célula. Los restantes 86 aminoácidos son la proinsulina: cadena B, péptido C y cadena A.

Los trozos inicial y final de esta molecula (B y A) interaccionan uno con otro y se enlazan mediante dos uniones de puente disulfuro (S-S). Después se fragmenta la parte central de la proinsulina (cadena C o péptido C, con 35 aminoácidos) por enzimas localizadas en la membrana (proteasas) en el aparato de Golgi de la célula.

La función de la cadena C consiste en alinear correctamente una tras otra las cadenas A y B. sin este correcto plegamiento en el espacio, la insulina no sería completamente activa.

La insulina activa y el péptido C se guardan en vesículas y se liberan juntos tras el estímulo. La “utilización diaria” de insulina por los humanos es de aproximadamente 1.8 mg.

¿Cómo se obtenía insulina antes de la tecnología del ADN recombinante?

Conversión enzimática de la insulina de cerdo a humana. 
Método desarrollado por la Hoechst Inc. en 1980.

La insulina utilizada antes de la terapia de la diabetes, se extraía del páncreas de toros o cerdos. Su secuencia de aminoácidos no coincide completamente con la insulina humana: en el cerdo hay un aminoácido distinto, en el de toro hay tres.

La insulina se incorporó dos años después de su descubrimiento al tratamiento de la diabetes. Por un lado eliminaba el síndrome principal de la enfermedad del azúcar; pero también tenía efectos secundarios indeseables. Así, algunos diabéticos desarrollaron alergia a la hormona animal, ya que era una proteína exógena para el sistema inmunitario, contra la que se podían formar anticuerpos.

La solución sería convertir la insulina de cerdo, con la ayuda de enzimas, en insulina humana. Los investigadores Hoechst Inc. encontraron, a principios de los años 1980, una elegante solución: el aminoácido alanina final de la insulina de cerdo se intercambia enzimáticamente por una treonina. La hidrolasa tripsina, además de hidrolizar en el estomago “todo fragmentable” para las proteínas, tiene una propiedad asombrosa: hidrolizar proteínas y péptidos exactamente de modo especifico junto a los aminoácidos lisina y arginina. Al final de la cadena B en el cerdo se encuentra, por suerte, la alanina y “antes” una lisina… ¡Maravilloso!

Así pudo romperse la alanina final. Primero va todo “norma”: la insulina de cerdo se trata con tripsina. Al mismo tiempo se añade un éster de treonina (éster terbutilo de treonina) y la reacción tiene lugar en un 55% de disolvente orgánico. Entonces ocurre algo asombroso: la reacción inversa de la enzima. Las proteasas pueden fraccionar péptidos con la ayuda de agua, ¡pero también los péptidos (y ésteres de aminoácidos) se pueden unir en un entorno pobre en agua! Este proceso se denomina transpeptidización. El éster de treonina se anexiona en el lugar de la rotura de la “alanina del cerdo”. Sólo se debe hidrolizar mediante el aporte de agua. Se origina así insulina activa por catálisis enzimática.

Este procedimiento dura aproximadamente seis horas, pero requiere, grandes cantidades de insulina de cerdo como materia prima.

Como era de esperar, en Hoechst se trabajó diariamente con casi una docena de toneladas de páncreas de cerdo de más de 100000 animales de matadero.

Experimento de Gilbert y Villa-Komaroff (1977)

En 1977, Walter Gilbert y Lydia Villa-Komaroff, de la Universidad de Harvard, utilizaron un tumor de células beta en páncreas de rata y a partir de ellas, introdujeron los genes para la insulina en bacterias.

Insertaron los genes de la insulina de rata en un plásmido junto con los genes de resistencia de penicilina y tetraciclina.

Utilizando técnicas de radioinmunoensayo se detectó la producción de la insulina en las bacterias y posteriormente se purificó, utilizando enzimas digestivas que retiraron el aminoácido tripsina y el péptido C.

El primer ensayo de insulina obtenida por técnicas de ADN recombinante se dieron en Inglaterra en 1980, utilizando 17 voluntarios. Dos años después se autorizó el uso médico en humanos de esta insulina.

Antes de la insulina, la primera proteína recombinante fue la somatostatina

Somatostatina

La primera proteína producida utilizando células bacterianas fue la somatostatina. Para ello se desarrollaron técnicas decisivas para la posterior producción de insulina.

La somatostatina consta solamente de 14 aminoácidos y es una de las muchas hormonas que se producen en el hipotálamo, una región del cerebro medio. Desde allí llega hasta la glándula pituitaria con el flujo sanguíneo, donde se ocupa de parar la liberación de insulina y del “apagado” de la hormona del crecimiento humana.

La somatostatina podría, por lo tanto, tener valor terapéutico. Por este motivo, en 1977 Hebert Boyer y sus colaboradores escogieron esta sustancia para sus investigaciones en el City of Hope National Medical Center y la Universidad de California en San Francisco. Hasta entonces no se había conseguido aislar el gen de la somatostatina de células humanas, pues su secuencia de bases se obtuvo del conocimiento del código genético a partir de la secuencia conocida de los 14 aminoácidos en el péptido.

Así se construyó en bloques, de tres bases cada uno, un gen artificial. Consta de 52 pares de bases, de las cuales 14 x 3 = 42 contenían el plan de construcción codificado para la somatostatina. Los diez pares de bases restantes debían garantizar la expresión del gen (comprensión de las instrucciones de construcción) mediante el ribosoma, facilitar el aislamiento de la hormona y finalmente liberar “extremos pegajosos”, que serían importantes para incorporar fragmentos de ADN de doble hebra en un plásmido (el vector). Como huésped se eligió Escherichia coli. Para llevar a cabo la transferencia se combinó el gen sintético con un plásmido que llevaba la descripción pBR322, así como un fragmento del operón lac.

Para una expresión efectiva de un gen clonado se requiere una señal clara que sea entendida por la célula huésped. Estos promotores vienen frecuentemente de un gen, que puede alcanzar un grado de expresión elevado en el huésped. Lo más sencillo es acoplar el ADN clonado al ADN de un gen propio de una célula y aprovechar al mismo tiempo sus promotores buenos funcionales. el gen de la somatostatina se incorporó en el extremo propio del gen bacteriano, en el cual se codifica la enzima β-galactosidasa. La β-galactosidasa es una enzima que se encuentra en grandes cantidades y degrada lactosa. Es una enzima inducible.

Tras la transferencia con éxito del plásmido en una célula de E. coli se produce, por lo tanto, una somatostatina en forma de proteína de fusión somatostatina-β-galactosidasa. En realidad es sólo un “péptido cola” de 14 aminoácidos, más corto, colgado a la enzima galactosidasa.

Mediante tratamiento con el producto químico bromocianuro (CNBr), la proteína se rompe sólo en el lugar donde se encuentra el aminoácido metionina, dejando la somatostatina finalmente separada de la β-galactosidasa.

Debido a que el gen se había producido sintéticamente, era una menudencia incorporar la metionina requerida al inicio de la molécula de somatostatina. Para ello simplemente se instaló el codón ATG para la metionina. Este proceso previo no se pudo evitar. Si no, la somatostatina, si se intenta producir por sí misma, se degrada muy rápido mediante enzimas (proteasas) bacterianas fragmentadoras de proteínas. Esto es evidente gracias a que la “buena confidente” galactosidasa está “escondida” y no se muestran apéndices de la somatostatina, que en otro caso se fragmentarían. Científicamente se dice: mediante su expresión como “proteína de fusión con acción propia de las bacterias”, la somatostatina exógena de las bacterias se protege de la degradación por las proteasas bacterianas.

El resultado fue que la somatostatina sintetizada en E. coli era completamente idéntica a la natural humana. Cada célula forma alrededor de 10000 moléculas de somatostatina. Esto era una hazaña extraordinaria, que animó a obtener otros péptidos.

Después de todo, el descubridor de la somatostatina animal, Roger Guillemin (nacido en 1924, premio Nobel en 1977 con Andrew V. Schally y Rosalyn Yalow), tuvo que trabajar con 500000 hipotalamos de cerebro de oveja para obtener aproximadamente cinco miligramos de la sustancia purificada de la hormona somatostatina animal.

Solamente ocho litros de la suspensión de las bacterias E. colirecombinantes aportaban ahora la misma cantidad de somatostatina humana.

Obtención de somatostatina por ingeniería genética

En el esquema se muestran los procedimientos para sintetizar y clonar un gene híbrido que permitió la producción de la hormona humana somatostatina en la bacteria Escherichia coli. Este fue el primer experimento en que se demostró que es posible producir proteínas humanas en bacterias. En este caso, el gene sintético que codifica para la hormona, el cual estuvo construido a partir de ocho fragmentos de ADN sintéticos, fue unido al extremo del gene que codifica para la enzima b-galactosidasa de la bacteria E. coli y ambos fueron clonados en el plásmido pBR322. Después de transformar a la bacteria con el ADN recombinante, el plásmido híbrido permitió la síntesis de una proteína híbrida b-galactosidasa-somatostatina (con el segmento de somatostatina en el extremo carboxilo de la proteína), que al ser purificada y tratada con bromuro de cianógeno, permitió liberar a la hormona somatostatina, a la cual se le comprobó su actividad biológica.

Obtención de insulina humana mediante cepas de Escherichia coli

Vectores de clonación de la insulina humana

La insulina humana recombinante fue la primera proteína recombinante producida comercialmente por estos métodos. Fue elaborada originalmente mediante la expresión, por separado, de los dos genes sintéticos que codifican para las cadenas A y B que forman esta hormona. Una vez sintetizadas cada una de estas cadenas por separado en cultivos diferentes de E. coli, fueron purificadas y unidas por métodos químicos para generar la insulina. Cada uno de los genes codificantes para cada cadena fueron sintetizados y ligados a un vector de expresión para que pudieran ser correctamente transcritos y traducidos en forma de una proteína de fusión con la enzima b-galactosidasa. El vector de expresión fue introducido en E. coli, y la proteína híbrida b-gal-cadena A o B de insulina se sintetizó y se acumuló en el citoplasma de las bacterias productoras. Las células se cosecharon y cada una de las proteínas de fusión se purificó por separado. Entre la región codificadora de las cadenas y el precursor de b-galactosidasa se agregó un triplete con el codón ATG el cual codifica para el aminoácido metionina, por lo que el tratamiento con bromuro de cianógeno que produce rompimiento de los residuos de metionina, libera intactas las cadenas de insulina. Las cadenas A y B se unen químicamente para producir insulina activa. 

Obtención de insulina humana utilizando dos vectores de clonación para cada cadena de la molécula