LA VIDA INTERIOR DEL GENOMA

ARTÍCULO: LA VIDA INTERIOR DEL GENOMA

              http://elmercaderdelasalud.blogspot.com/2011/09/la-vida-interior-del-genoma.html

GRIPE ¿Y TÚ DE QUIEN ERES?

https://www.heraldo.es/noticias/suplementos/tercer-milenio/innovacion/2018/02/19/gripe-quien-eres-1223985-2121030.html

CLONACIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS (ACTIVIDAD PADLET)

CLONACIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS

MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

La secuenciación de los ácidos nucleicos es el proceso de determinación de la secuencia de nucleótidos que componen una molécula de ADN o de ARN y que se representa por las iniciales de las bases nitrogenadas que portan.

Evolutivamente, desde los inicios de las técnicas de hibridación a principios de los 80, hasta la actualidad se han desarrollado las siguientes técnicas:

• Técnicas manuales basadas en reacciones químicas o enzimáticas (Maxam y Gilbert/Sanger).
• Secuenciaciones automáticas basadas en el método de Sanger ( 1ª, 2ª y 3ª generación) ; obtención de electroferogramas.
• Pirosecuenciación ( Detección óptica)

                                      MÉTODO DE MAXAM Y GILBER

Secuenciación química de Maxam-Gilbert. El fragmento de ADN que se desea secuenciar se desnaturaliza (1), se marca el extremo 5' con radiactividad (2), la muestra se divide en cuatro alícuotas que son tratadas con diferentes reactivos químicos que cortan al ADN en bases específicas (A, t, C, G) (3), en cada alícuota, queda una colección de fragmentos de ADN de diferente tamaño que termina en una base específica. Los fragmentos se separan electroforéticamente en un gel de poliacrilamida (4) y se visualizan y analizan por medio de una radiografía (5). 

Secuenciación de Sanger y Pirosecuenciación

ELECTROFEROGRAMAS

 Interpretación de electroferogramas

PIROSECUENCIACIÓN 

                                              Secuenciación de alto rendimiento

PADLET PCR

                                               https://padlet.com/biomolab12/p338locwhtes

EL GEN VIKINGO Y LA RESISTENCIA AL VIH

Desde 1988 se festeja el 1 de diciembre de manera anual el día mundial del HIV (por sus siglas en inglés: virus de la inmunodeficiencia humana)/síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según estadísticas de la Organización Mundial de la Salud, se estima que en el año 2012 más de 35 millones de personas en el mundo están infectadas con este virus.

Las personas se infectan con bacterias, virus, hongos y parásitos, pero algunas se enferman más que otras cuando tienen contacto con estos microorganismos.

Diferentes mutaciones (alteraciones) de genes afectan como una persona se infecta mas fácilmente, mientras que otra es resistente a la infección, o sea, no se infecta. Aunque los factores ambientales también juegan un rol, el objetivo de estudio en múltiples laboratorios de investigación del mundo es identificar genes que participan en este mecanismo para desarrollar medicamentos que puedan bloquear o retrasar una infección.

Desde la década de 1980 cuando el HIV fue descubierto por Luc Montagnier y Francoise Barré-Sinuossi, ganadores del Premio Nobel de Medicina (2008), hay millones de personas en todo el mundo que están enfermas con el SIDA causada por el virus HIV. Lo sorprendente es que no todas las personas expuestas al virus se enferman. Los científicos han estudiado cuidadosamente las personas que parecieran ser resistentes a la infección por el HIV.

Diferentes grupos científicos intrigados con este fenómeno, analizaron y estudiaron como el HIV interactúa con las células de nuestro cuerpo. El HIV entra a nuestro organismo a través de relaciones sexuales no protegidas (sin preservativo) o con la utilización de agujas como en el caso de las drogas ilegales.

A nivel molecular, el HIV entra a ciertas células de nuestro cuerpo utilizando los llamados receptores, ciertas proteínas especiales que están localizadas en el exterior de todas células. Los receptores tienen la función de ser como un ‘’una puerta de entrada’’. Cuando tienen contacto con una molécula, generalmente otra proteína, transmiten el mensaje hacia el interior de la célula, lo que se denomina una transducción de una señal. El HIV infecta a los seres humanos ingresando a los linfocitos T (glóbulos blancos que forman parte del sistema inmune y son los encargados con otras células del sistema inmune de normalmente combatir los microorganismos) a través de su receptor denominado CD4. La evolución normal de la enfermedad hace que el HIV luego de infectar a los linfocitos T CD4 normalmente los destruye y afecta al sistema inmune en general causando las infecciones que caracterizan a este síndrome.

Se ha demostrado que para que el HIV finalmente pueda infectar los linfocitos T necesita la presencia de otro receptor llamado CCR5. La acción en conjunto de los receptores CD4 y CCR5 es la verdadera ‘’puerta de entrada’’ permitiendo el ingreso del HIV a la célula, y de esa manera, poder infectar los linfocitos T.

Las personas resistentes a la infección por HIV tienen una mutación (alteración) en el gen CCR5 (localizado en el brazo corto (p) del cromosoma 3: 3p21) llamada CCR5-delta32. El resultado de la mutación CCR5-delta32 es la formación (síntesis) de una proteína que no es funcional, o sea, el receptor no cumple su función normalmente. Eso significa que uno de los componentes de la ‘’puerta de entrada’’ no funciona, y por ende, el HIV no va a poder entrar a los linfocitos, y, como consecuencia no va a poder infectarlos.

Las personas que tienen 2 copias del gen CCR5 mutado (alterado) con la variación llamada delta32 son inmunes a la infección por el HIV. Esto significa que si una persona tiene sus 2 copias del gene CCR5 mutadas no se va a infectar con el HIV. Este sorprendente fenómeno no es infrecuente, ya que ocurre en aproximadamente 1% de las personas de raza blanca (descendientes de Europa del Norte, caucásicos). Una teoría sugiere que esta mutación se originó en Escandinavia (Dinamarca, Noruega y Suecia) y migró hacia el sur de Europa con las invasiones que realizaron los vikingos de acuerdo al estudio publicado por Novembre y colaboradores en la revista PLoS Biol (2005). Hay otro fenómeno biológico que también es interesante mencionar. Cuando la persona solo tiene una copia del gen CCR5 con la mutación delta32, la persona se infecta con el HIV, pero según diferentes estudios científicos pareciera ser menos probable su progresión al cuadro más grave, el SIDA. Esta situación es más frecuente, ya que se encuentra en hasta el 20% de las personas de origen caucásico de acuerdo a los estudios de Ioannidis y Marmor publicados en las revistas Ann Intern Med (2001) y J Urban Health (2006), respectivamente.

En la actualidad se realizan varios test genéticos para el diagnóstico y la determinación del pronóstico de varias enfermedades. Pero, no es necesario que la población se haga una prueba genética para determinar si es portador (“carrier”) de la mutación CCR5-delta32, ya que el virus en algunos casos puede utilizar otros receptores como mecanismos de infección.

Un concepto y recomendación importante: que una persona sea resistente a la infección por HIV porque tiene los 2 genes CCR5 mutados, no significa que no deba cuidarse con preservativo, ya que otros genes y proteínas pueden facilitar la entrada del virus a los linfocitos T. Aunque la medicina avanza, y estos hallazgos son realmente increíbles, el mensaje es claro, todas las personas deben seguir tomando medidas de protección para evitar una infección con este virus.

DETECTADO "IN VIVO" ADN DE CUATRO CADENAS

ESTRUCTURA G-QUADRUPLEX

http://www.elmundo.es/ciencia-y-salud/ciencia/2018/04/23/5addf8e5e2704e0d538b457e.html

METODO OSNA ( DETERMINACIÓN DE CÉLULAS TUMORALES EN EL GANGLIO CENTINELA)

https://www.sysmex.es/fileadmin/media/f117/Documents/Sysmex_OSNA_cancer_mama.pdf
https://www.sysmex.es/fileadmin/media/f117/OSNA/OSNA_RD-100i_6p_ES.pdf

MICROARRAYS

HIBRIDACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA DE MICROARRAYS

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

ACTIVIDAD COOPERATIVA (PADLET)

https://padlet.com/biomolab12/xwa5p5sayrlc

Mayor resolución en la genotipación del ADN gracias a un biosensor de grafeno

Investigadores de la Universidad de California San Diego han desarrollado un chip capaz de detectar las moléculas de ADN (o ARN) que contengan una mutación, mediante la hibridación a una sonda incrustada en grafeno. 

Bioingenieros de la Universidad de California en San Diego han desarrollado un biosensor, basado en grafeno, capaz de detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con una mayor resolución que las tecnologías tradicionales de detección de mutaciones puntuales.

Los SNPs son variaciones de la secuencia de ADN que afectan únicamente a una sola base (A, C, G o T), y cuya presencia genera una gran diversidad entre individuos de la misma especie. Aunque la mayoría de estas mutaciones son inocuas, algunas de ellas juegan un papel fundamental en la salud de los organismos. Es por ello, que pueden emplearse como marcadores de múltiples enfermedades como el cáncer, la diabetes, problemas del corazón, desórdenes neurodegenerativos y enfermedades autoinmunes o inflamatorias. 

El desarrollo de chips digitales capaces de detectar mutaciones, asociadas a dichas enfermedades, con una alta sensibilidad y especificidad, es esencial para poder implementar una efectiva medicina personalizada.

¿EN QUÉ CONSISTE?

El trabajo muestra el diseño de un chip capaz de capturar las moléculas de ADN o ARN que contengan una mutación, mediante la hibridación de dichas moléculas con una sonda incrustada en el grafeno. Dicha sonda consiste en una secuencia de doble cadena de ADN, complementaria a la región donde se encuentra la mutación o SNP a analizar. En ella, ambas hebras están unidas débilmente entre sí debido a la sustitución, en una de ellas de algunas guaninas por iosinas. La cadena normal está unida firmemente al grafeno, mientras que la que tiene las modificaciones no lo está. De este modo, cuando la sonda es expuesta a las moléculas de ADN o ARN de una muestra, el fragmento que presenta el SNP, desplaza a la secuencia complementaria (pero con modificaciones) de la hebra fijada al grafeno, por su mayor complementariedad con esta última 

(debido a la ausencia de modificaciones), y se une a ella permitiendo detectar el SNP. Esta unión desencadenará una señal eléctrica, que puede ser registrada por un sistema informático para su posterior análisis y procesamiento. El sistema ofrece la posibilidad de poder ser implantado en el cuerpo, facilitando la detección del SNP a tiempo real, además de poder transmitir la información de forma inalámbrica a un dispositivo electrónico, como un smartphone o una tablet.

Según el profesor de Bioingeniería, es un método digital rápido y de bajo costo para la detección de mutaciones con una alta resolución, basadas en el cambio de un solo nucleótido dentro de una secuencia de ácidos nucleicos.

VENTAJAS

La nueva tecnología supone una alternativa más sensible, específica, rápida y portátil que los anteriores métodos de detección de SNPs. Frente a éstos métodos, basados en carga eléctrica, enzimas o fluoróforos, que utilizaban sondas de cadena sencilla, el nuevo biosensor ofrece una mayor precisión. Esto se debe a que con la doble cadena únicamente una secuencia totalmente complementaria puede reemplazar la cadena unida “débilmente” mientras que con la cadena sencilla cualquier secuencia mínimamente complementaria podría hibridar y generar falsos positivos. Además, gracias a ésta mayor especificidad, la doble cadena puede ser empleada en la detección de mutaciones en fragmentos más largos.

Los investigadores confían en poder optimizar y aplicar la nueva tecnología en el ámbito clínico para la generación de nuevos métodos de diagnósticos y tratamientos personalizados.Es el primer ejemplo de la combinación de la nanotecnología de ADN dinámica con un sensor electrónico de alta resolución. 

El resultado es una tecnología que podría ser potencialmente utilizable con dispositivos electrónicos inalámbricos para detectar SNPs.

NOTICIA SOBRE EL CÁNCER DE MAMA

Hallan una proteína que mantiene dormida las células metastásicas del cáncer de mama

.https://drive.google.com/open?id=0B3-iYiQk4z_5blBKeTR6b0FxS0swSGVmNGZnTnpxTTY5TDY0

MOSQUITO MODIFICADO GENÉTICAMENTE PARA LA ERRADICACIÓN DE LA MALARIA

MOSQUITO MODIFICADO GENÉTICAMENTE PARA LA ERRADICACIÓN DE LA MALARIA

Un mosquito modificado genéticamente podría ayudar en la erradicación de la malaria, una enfermedad que cada año causa al menos 600.000 muertes, el 90% de las cuales son de menores de cinco años. El insecto ha sido diseñado por un equipo norteamericano de científicos con dos alteraciones genéticas que hacen que sea incapaz de transmitir el parásito Plasmodium falciparum, causante de la malaria, a los humanos. 

Para ello, han utilizado una tecnología de edición genética nueva muy potente, aunque también controvertida, que permite introducir genes antimalaria en el propio ADN de los mosquitos con el objetivo de que estos, al aparearse con insectos salvajes, transmitan la resistencia a la enfermedad a su descendencia. Y de esta forma se extienda la incapacidad de contagio entre las poblaciones salvajes de estos insectos.

En concreto, tal como recoge la revista Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), biólogos de la Universidad de California han usado el Anopheles stephensi, una especie de mosquito responsable de más del 10% de los casos de la enfermedad en la India, y mediante una técnica llamada Crispr-Cas9 han introducido en el ADN del propio animal un gen de resistencia contra el parásito de la malaria. De esta forma, los mosquitos con estos genes son resistentes a Plasmodium y no contagian la malaria.

Por otra parte, otro equipo, esta vez de la Universidad de California San Diego, ha introducido una segunda modificación genética para propiciar que esos genes de resistencia sean dominantes y se expandan rápidamente entre la población salvaje de mosquitos. Así, cuando se liberen, esos insectos transgénicos se aparearán con mosquitos no modificados y pasarán los genes antimalaria a su descendencia, de forma que se irá aumentando la proporción de generaciones de insectos resistentes al parásito.

Ya en los experimentos realizados en el laboratorio, los investigadores han observado que los mosquitos transgénicos son capaces de transmitir sus genes antimalaria al 99,5% de su descendencia.

Una herramienta poderosa

Estos insectos no serán, aseguran los investigadores, la solución definitiva pero podría ser un arma muy eficaz que se uniría al resto de técnicas empleadas en la actualidad para luchar contra la enfermedad, como las mosquiteras impregnadas en insecticida, los repelentes de mosquitos y la medicación que se administra cuando una persona se infecta.

En el artículo publicado en PNAS, los autores afirman que “las cepas basadas en esta tecnología podrían tener un papel importante en mantener la malaria bajo control y luchar para eliminarla, como parte de la agenda de erradicación”.

Y esta modificación abriría también la puerta no solo a acabar con la malaria, sino también con el dengue y otras enfermedades.

Consecuencias ecológicas impredecibles

Aunque pueda parecer que conseguir que la población de mosquitos salvajes se vuelva inmune al parásito de la malaria solo tenga consecuencias beneficiosas, los expertos reclaman cautela y prudencia. La tecnología de edición genética es tan potente que este verano en la revista Science ya un nutrido grupo de científicos de los Estados Unidos, Reino Unido, Japón, y Australia reclamaban que si bien el ‘corta y pega’ genético podía salvar vidas, también podía comportar “consecuencias ecológicas impredecibles”.

Por el momento no se han liberado al medio ambiente animales modificados genéticamente con modificaciones dominantes, por lo que los autores del estudio quieren comprobar todos los posibles escenarios antes de hacerlo. Podría suceder que, por ejemplo, los genes de resistencia sufrieran mutaciones que impidieran que se heredaran. O que la selección natural favoreciera otros genes en detrimento de estos. También, que la expansión de estos animales causaran algún tipo de desastre natural al liberarse al medio ambiente.

De hecho, con anterioridad otro equipo de científicos había intentado modificar mosquitos para hacer que fueran estériles, de manera que en un tiempo el que es el principal vector de transmisión de la malaria podría llegar a extinguirse. No obstante, los expertos alertaron de que eso podría tener consecuencias muy negativas. De ahí que la opción de diseñar otros inofensivos para los humanos será una posible alternativa.

Hibridación

La hibridación in vitro es un fenómeno importante y muy utilizado en todas las áreas de la biología molecular. Recuerda que la temperatura (y algunos agentes químicos) pueden desnaturalizar el DNA de forma reversible siempre que la temperatura (o la sustancia) disminuya lentamente. Si se hace descender bruscamente, cada hebra de DNA tiende a reasociarse consigo misma y formar un ovillo que se estabiliza por fuerzas intramoleculares. Como consecuencia, se obtiene un DNA sin utilidad y cuya absorbencia es menor que el desnaturalizado, pero mayor que como dsDNA.

Principios básicos

La hibridación entre secuencias se basa en la especificidad de la interacción entre las bases nitrogenadas de distintas cadenas, de manera que se favorezca su asociación y se disminuya la posibilidad de reasociaciones intracatenarias así como las hibridaciones inespecíficas. Para empezar, hay que contar con una secuencia diana (target) dentro de un fragmento de DNA y con una sonda (probe), que no es más que un fragmento pequeño de DNA de secuencia conocida y complementaria a la secuencia de diana. Cuando la sonda y la diana se encuentran, el dúplex se identifica con radiactividad, fluorescencia o colorante, según de la manera en que la sonda se haya marcado.

El DNA a hibridar debe digerirse previamente con una o varias enzimas de restricción para dar lugar a una serie de fragmentos individualizados que se pueden resolver en una electroforesis en un gel de agarosa. Este gel de agarosa se «replica» sobre un filtro de nitrocelulosa o nilón mediante la transferencia (blot) del DNA desde el gel hasta el filtro. Esta transferencia se produce por capilaridad desde el gel hasta el filtro. También se han desarrollado métodos rápidos por transferencia al vacío. Para que el DNA se transfiera es necesario sumergir el gel en una solución alcalina, de manera que éste de desnaturaliza al romperse los puentes de hidrógeno. La desnaturalización del DNA es esencial para que, posteriormente, la sonda pueda encontrar su secuencia complementaria. Si el DNA a transferir es de gran tamaño, entonces conviene dar antes un tratamiento con rayos UV o una solución ácida para introducir mellas que permitan que los fragmentos difundan a través de la agarosa. A continuación, el gel se neutraliza para permitir que el DNA desnaturalizado se transfiera como cadenas sencillas a la membrana.

Una vez inmovilizado el DNA sobre el filtro, se rastrea (screening) el fragmento con la sonda específica. Se forman así una serie de DNA híbridos bicatenarios cuya estabilidad va a depender de la cantidad de bases apareadas: cuanto más larga es la sonda y más bases se aparean y más estable es el híbrido. En general, a mayor grado de hibridación, mayor conexión evolutiva entre especies, y viceversa.

Control de la hibridación

La especificidad de la hibridación se puede modificar mediante:

•   La cantidad de GC que tiene la secuencia que se hibrida: a mayor %GC, más fuerte resulta la hibridación y más alta será la temperatura a la que se pueden hibridar para garantizar la especificidad de la hibridación.

•   También influye la composición de bases de la sonda, ya que a mayor %GC, más fuerte resulta la hibridación.

•   El número de copias de la secuencia de diana es clave, puesto que un número demasiado bajo hace que la técnica no tenga suficiente sensibilidad como para que, después de haberse hibridado la sonda con la diana, podamos detectar tales híbridos.

•   La concentración de la sonda es también clave por la misma razón que la anterior.

•   El tamaño de la sondava a permitir que se hibriden suficientes pares de bases de manera que el híbrido sea suficientemente estable para que se pueda detectar y no se deshaga durante las manipulaciones. Con unos cientos de pb basta: por la forma en la que se preparan las sondas (son fragmentos de la plantilla), no suele tener sentido elegir sondas de varias kilobases de longitud.

•   El rigor (stringency) de la hibridación. Con este concepto se agrupan varios factores experimentales como la temperatura, el tiempo y la fuerza iónica entre otras. Se trata del grado de especificidad del apareamiento conseguido en los híbridos. De él va a depender que sólo se apareen las secuencias exactamente complementarias, o simplemente muy parecidas, según sean los objetivos del experimento. Hay que procurar que no sea tan alto que impida el apareamiento de la sonda homóloga, ni tan bajo que permita una hibridación inespecífica con secuencias poco relacionadas. En este último caso, se diría que hay mucho ruido de fondo (background) en el ensayo. Para conseguir unas condiciones muy rigurosas hay que subir la temperatura, disminuir la fuerza iónica, y añadir formamida o urea.

Tipos de hibridaciones

Las características principales de la hibridación que hemos venido comentando corresponden a la transferencia Southern desarrollada en 1975 por Edward. M. Southern y cuya principal ventaja es que el DNA diana se encuentra fijado sobre un soporte sólido. Inicialmente se utilizó nitrocelulosa a la que se unía covalentemente el DNA al vacío. Hoy se usan membranas de nilón, que son menos delicadas y basta con exponerlas al UV unos minutos para que el DNA se fije a ella. Requiere una separación electroforética, desnaturalización, transferencia, hibridación y detección del DNA de la diana.

De una manera similar, está la transferencia Northern cuyo nombre viene por un juego de palabras con el apellido del autor de la transferencia Southern. El razonamiento es idéntico al anterior, salvo que las moléculas que se separan son de RNA y se emplea medio ácido para desnaturalizar, en lugar del básico. Suele emplearse para obtener información sobre el tamaño del RNA o la expresión de los genes.

La transferencia en ranura (slot-blot) es también análogo al Southern, pero no necesita una previa purificación ni separación de los ácidos nucleicos, sino que éstos se depositan en masa sobre una ranura (slot) que permite fijarlo en una determinada posición sobre un filtro de nilón o nitrocelulosa. Si en lugar de depositarlo en una ranura se deposita gota a gota, se denomina transferencia puntiforme (dot-blot).

También se realizan hibridaciones directamente sobre colonias de bacterias o de levaduras que se han transferido directamente sobre un filtro: hibridaciones Grunstein (el nombre de nuevo proviene del autor que la describió). Permite localizar colonias de una genoteca que contienen una determinada secuencia.

Los modernos análisis con micromatrices (microarray) siguen los mismos principios de la transferencia Southern, solo que en el soporte de cristal (es un portaobjetos) se fijan miles de sondas, y lo que se marca y se añade para la hibridación es la diana (normalmente RNA de una situación fisiológica). De esta manera, se verifica el comportamiento de miles de genes en un momento determinado —en lugar de ver qué le pasa a un gen en unas poquitas condiciones, como ocurre en el southern—.

Hay otra serie de técnicas como la PCR, secuenciación, hibridaciones in situ, análisis de inicio de transcripción etc. en las que la hibridación se produce en medio líquido y luego se detectan los híbridos de muy diversas formas.